2008年08月13日

静岡県の特許申請。

【発明の名称】 豚胚の発生補助方法及びこの方法を利用してGFP遺伝子を導入した体細胞、GFP遺伝子を導入した金華豚およびその子孫
【発明者】 【氏名】河原▲崎▼ 達雄

【氏名】柴田 昌利

【氏名】土屋 聖子

【氏名】大竹 正則

【氏名】東 貞宏

【要約】 【課題】

【解決手段】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
豚胚と単為発生胚とを同時移植することによって豚胚を豚産子にまで発生させる豚胚の発生補助方法。
【請求項2】
請求項1の豚胚の発生補助方法において、前記特定の豚胚がGFP遺伝子を導入した豚胚であることを特徴とする豚胚の発生補助方法。
【請求項3】
GFP遺伝子を導入したことを特徴とするGFP遺伝子を導入した体細胞、GFP遺伝子を導入した金華豚およびその子孫。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
この発明は豚胚の発生補助方法及びこの方法を利用してGFP遺伝子を導入した体細胞、GFP遺伝子を導入した金華豚およびその子孫に関する。前記豚胚の発生補助方法は、主として、クローン胚等の遺伝子を組み換えた豚胚を産子にまで発生させる場合に使用され、また、前記GFP遺伝子導入金華豚は医学用等の実験動物として使用される。
【背景技術】
【0002】
豚胚の移植は、優れた種豚を増産したり、豚の導入時の疾病の侵入を防止できる等、産業的に活用ができる。例えば、クローン胚(技術)は、遺伝資源を細胞により保存することを可能にし、貴重な豚や優良な豚を増産することを可能にするし、遺伝子組換え胚は医薬品を生産する豚を作製したり、臓器移植に利用できる豚を作製することができる。
【0003】
多体動物である豚では、妊娠初期に4個以上の胚が存在しないと妊娠を継続することができない。このため、従来においては、クローン胚、受精胚等の特定の豚胚に、4個以上の補助受精胚の同時移植を行い、その生存性を高めていた。
【0004】
【非特許文献1】J.Reprod.Fert.(1996)12,395-397
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、かかる従来の方法において、補助受精胚は、動物から直接入手しなければならないため、入手するにあたって一定の技術を要するとともに多くの経費および時間がかからざるを得ないという不都合を有した。
【0006】
この発明の課題は係る不都合を解消することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記課題達成するために、この発明に係る豚胚の発生補助方法においては、豚胚と単為発生胚とを同時移植することによって豚胚を豚産子にまで発生させるものである。
【0008】
なお、前記豚胚をGFP遺伝子を導入した豚胚にすることもできる。
【0009】
また、この発明に係るGFP遺伝子導入金華豚においては、GFP遺伝子を導入したことに特徴を有するものである。
【発明の効果】
【0010】
この発明に係る豚胚の発生補助方法は上記のように構成されているため、即ち、補助受精胚の代わりに、安価で容易に作製できる単為発生胚を使用しているため、クローン胚、受精胚等の豚胚の移植を、従来必要とした一定の技術を要することなく、また、従来に比較して少ない経費および時間で作業ができるものである。
よって、この豚胚の発生補助方法を使用すれば、クローン胚、受精胚等の豚胚の移植の作業能率を向上させることができる。
【0011】
なお、前記豚胚をGFP遺伝子を導入した豚胚にすれば、GFP遺伝子を導入した豚を容易に発生させることができるものである。
【0012】
また、この発明に係るGFP遺伝子導入金華豚は、内臓器の大きさがヒトに近く、医学用等の実験動物として従来存在しなかった豚を提供することができる。
【0013】
また、このGFP遺伝子導入金華豚は、PCR解析によりGFP遺伝子が導入されていること、皮膚、筋肉、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、白血球、骨髄などほとんどすべての細胞において緑色蛍光タンパク質の存在を確認することができた。
【0014】
さらに、このGFP遺伝子導入金華豚は正常に発育すること、GFP遺伝子導入クローン豚から採取、増殖した体細胞のほとんどはGFPを産生しており、この体細胞を用いたクローン豚(リクローン豚)を作製することもできる。
【0015】
今回の発明で作製したGFP遺伝子導入金華豚体細胞、GFP遺伝子導入金華豚およびその後代豚は医学用等の実験に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
多胎動物である豚は妊娠初期に数個の生存胚が存在しないと妊娠が成立せず、少数の正常クローン胚が存在しても産子にまで発生させることができなかったが今回は単為発生胚を同時移植することによりこの問題を解決した。
【0017】
1個の受精胚と単為発生胚を同時移植すれば、表1に示すように、1個の受精胚を産子にまで発生させることができることが明らかになった。
【表1】


【0018】
また、表2に示すように、GFP遺伝子導入クローン胚と単為発生胚を同時移植する方法により、仮母豚からそれぞれ1頭ずつ、合計4頭のGFP遺伝子導入クローン豚を誕生させることに成功した。このことから、単為発生胚の同時移植はクローン胚の発生率の改善にも効果的であることが明らかとなった。
【表2】



【0019】
次に、金華豚は体重が一般の豚の約2分の1と小さく、繁殖能力が高く、肢蹄が強健であり、実験動物としての利用性に富んでいる。また、金華豚の体細胞は、表3に示すように、クローン豚の作製効率が高いものである。
【表3】


【0020】
一方、GFP遺伝子はオワンクラゲから得られた遺伝子であり、組み込まれた動物の生体内で単独に発現し、緑色の蛍光シグナルを発するタンパク質を生産する。
【0021】
また、生産されたGFPは生体にとって無害である。
【0022】
これまでに、GFP遺伝子を導入されたマウスなどが開発され、実験動物として利用されてきたが、医療分野での実験ではヒトに近い体格や生理的な特性を持つ豚を利用する方が有利である場合も多い。
【0023】
今回の発明では、体重が一般の豚の約2分の1とヒトに近く、繁殖能力や強健性に富んだ金華豚の体細胞へ、GFP遺伝子(図1を参照のこと)を導入し、核移植技術を利用して、GFP遺伝子を導入したクローン金華豚を作製した。
【0024】
作製されたGFP遺伝子導入金華豚は、PCR解析により、GFP遺伝子が導入されていることが確認された(図2を参照のこと)。紫外線を照射すると蹄、鼻鏡、舌などが蛍光色を呈し(図3を参照のこと)、蛍光顕微鏡による観察でも、表4に示すように、皮膚、蹄、舌、筋肉、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、白血球、骨髄などほとんどすべての細胞で緑色蛍光タンパク質の存在が確認され(図4を参照のこと)、遺伝子が正常に機能していることが証明された。また、 GFP遺伝子導入金華豚は、図5から明確なように正常に発育することも確認された。
【表4】



【0025】
さらに、表5に示すように、GFP遺伝子導入クローン金華豚から採取、増殖した体細胞のほとんどはGFPを産生しており、この細胞を用いたクローン豚(リクローン豚)の作製が可能であることも確認された。
【表5】







【0026】
今回の発明で作製したGFP遺伝子導入金華豚体細胞、GFP遺伝子導入金華豚およびその後代豚は医学用等の実験に有効である。例えば、臓器移植実験では、移植細胞の消長をGFPシグナルの検出により解析することが可能となる。
【0027】
また、単為発生胚の同時移植による胚の発生補助技術もクローン胚、受精胚などの生存性を高め、生産性を改善するために有効な技術である。
【実施例1】
【0028】
以下、この発明の実施例を説明する。
今回の発明で作製したGFP遺伝子導入金華豚体細胞、GFP遺伝子導入金華豚およびその後代豚は医学用等の実験に有効である。例えば、臓器移植実験では、移植細胞の消長をGFPシグナルの検出により解析することが可能となる。また、単為発生胚の同時移植による胚の発生補助技術もクローン胚、受精胚などの生存性を高め、生産性を改善するために有効な技術である。
【産業上の利用可能性】
【0029】
補助受精胚の代わりに、安価で容易に作製できる単為発生胚を使用しているため、クローン胚、受精胚等の豚胚の移植を、従来必要とした一定の技術を要することなく、また、従来に比較して少ない経費および時間で作業ができ、クローン胚、受精胚等の豚胚の移植の作業能率を向上させるために利用することができる。
【0030】
また、豚は体格や生理的特性がヒトに近く、医療用の実験動物として注目されている。また、医療用実験動物として活用するにあたり、あらかじめ細胞が標識されていれば、移植細胞の消長などの解析が可能となる。このような見地から、GFP遺伝子導入クローン金華豚は、再生医療や臓器移植などの実験動物としてその利用価値はさらに高まるものである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図1は導入したEGFP遺伝子を含むDNAのコンストラクトの説明図である。
【図2】図2はPCR法によるGFP遺伝子の増幅を示したチャートである。このチャートにおいて、MはDNAサイズマーカー、1はクローン豚、2は一般豚を示している。
【図3】図3は誕生したGFP遺伝子導入体細胞クローン豚の写真である。紫外線をあてると、四肢の蹄、鼻鏡、舌などからの緑色蛍光の発現(矢印)が確認される。
【図4】図4は組織内GFPを確認した写真である。耳皮膚組織内のGFPの存在を蛍光顕微鏡にて確認したものである。
【図5】図5はGFP遺伝子導入豚の発育状態を示したグラフである。
【出願人】 【識別番号】590002389
【氏名又は名称】静岡県
【出願日】 平成17年3月31日(2005.3.31)
【代理人】 【識別番号】100083530
【弁理士】
【氏名又は名称】野末 祐司

【公開番号】 特開2006−280203(P2006−280203A)
【公開日】 平成18年10月19日(2006.10.19)
【出願番号】 特願2005−100450(P2005−100450)
ニックネーム りぼん。パパ at 18:58| Comment(0) | TrackBack(0) | 日記 | このブログの読者になる | 更新情報をチェックする
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